La costruzione di una prima piccola chiesa, nei pressi del pozzo dove venne miracolosamente rinvenuto il quadro della Madonna di Pozzano, è databile intorno all’inizio del XV secolo[4], testimoniato nel 1419, da alcuni privilegi di Giovanna II di Napoli[5]: la zona era già in epoca romana sede di un tempio pagano, dedicato alla dea Diana, come dimostrato da una colonnamarmorea, ritrovata nel 1585[6], in seguito a lavori di scavo della chiesa e poi posta ai piedi di una croce, posizionata in modo panoramico poco prima dell’ingresso della basilica[7].
Dal 1447, in un periodo in cui la Vergine di Pozzano non godeva di grossa devozione, la chiesa passò ai frati francescani, i quali furono poco dopo scacciati da Ferdinando I di Aragona, su consiglio del parroco che nutriva gelosia nei loro confronti[8]; in seguito, san Francesco, ospite alla corte di Napoli, in viaggio verso Tours, sostò in preghiera a Pozzano, davanti l’effigie della Madonna per tre giorni e tre notti[8]. La nuova ammissione dei frati alla chiesa fu sancita ufficialmente nel 1506[9] da papa Giulio II[4]: in poco tempo fu fatta riedificare, su ordine del vescovo stabiese Antonio Flores e del governatore di Napoli Corrado Ferrante, con l’aiuto economico del Gran Capitano Gonzalo Fernández de Córdoba, una chiesa più grande, i cui lavori durano dal 1506 al 1539[8]; furono costruiti in seguito il convento, nel 1565 la sagrestia e nel 1584 il campanile[4].
Durante il XVIII secolo il santuario conobbe il periodo di massimo splendore[10]: la chiesa fu notevolmente ampliata, fu costruito il nuovo altare maggiore, la cappella di san Francesco, venne ricostruita nel 1754 la sagrestia, su disegno di Luigi Vanvitelli, fu decorato il soffitto principale e gli interni impreziosito con numerose opere d’arte di artisti come Sebastiano Conca, Girolamo Cenatiempo, Giacinto Diano ed altri appartenenti alla scuola di Luca Giordano e Raffaello Sanzio[10]. Nel XIX secolo, con la soppressione delle case religiose, il santuario cadde in rovina e solo nel 1895 i frati poterono riacquistare la chiesa, il convento e l’orto[10]: nel frattempo però avvenne la solenne consacrazione il 26 giugno 1874 da parte di monsignor Saverio Petagna ed il 2 luglio 1875 il quadro della Vergine fu incoronato[4].
Nel 1916 la chiesa fu elevata al rango di basilica pontificia da papa Benedetto XV[4]. Durante la prima guerra mondiale il convento divenne ospedale militare e subito dopo orfanotrofio per i figli dei caduti[10], mentre durante la seconda guerra, i bombardamenti provocarono ingenti danni, tanto che, ricevuti i sostentamenti statali per danni bellici, nel 1947 iniziarono importanti lavori di ristrutturazione, che però portarono all’abbattimento del chiostro che conservava affreschi raffiguranti la vita di san Francesco[10]. Il terremoto dell’Irpinia del 1980 provocò ancora una volta danni all’intera struttura: seguirono una serie di lunghi restauri che si sono conclusi nel 2006[4]; nel 1994, nel transetto del coro, furono rinvenuti affreschi e pitture di Sebastiano Conca.